访福建省肿瘤医院许春伟博士：新型NGS技术临床应用前景广阔，肿瘤精准医疗未来可期！

近日，我们发布了文章“突破：RNA+DNA同时测序，检测癌症组织中的基因融合和碱基突变！”，报道了由浙江省肿瘤医院牵头、恒特基因等国内多家单位共同合作完成的一项研究，文章介绍了一种整合的NGS检测方法“双核酸模板测序”，该方法能够检测报告出从组织样本中提取的总核酸（TNA）中的多种变异类型，并极大地简化了变异检测流程。现在，让我们与《e药安全》编委同时为文章第一作者之一——福建省肿瘤医院许春伟博士，一起来谈谈这项技术的应用与发展相关问题。

问：许博士您好，我们得知刚刚发表在Clinical Chemistry上的一篇文章中提到，通过DNA+RNA同时测序来检测癌症组织中的基因融合和碱基突变，这是一个创新的工作。您是文章共同一作，您能否谈一谈“双核酸模板”测序的意义在哪里？

答：我们知道基于DNA检测的大Panel可以覆盖几百个癌基因，是大规模探测突变的强有力工具，但在融合/重排检测方面由于假阳性等各方面原因仍具有一定挑战，靶向二代测序是一种能够综合鉴定肿瘤生物标志的方法，根据不同的变化情况，起始检测材料可为DNA或RNA，但分别进行两次检测由于样本量缺少的问题常常不可实现，进而延误或完全没有检测到关键变异事件，特别是那些有效的可靶向治疗的融合事件，因此双核酸模板单次检测是实际工作中迫切需求的。

问：能否介绍一下，您在这项工作中负责哪部分内容？在您看来，这项工作可能为医疗行业带来什么样的改变？

答：我的专业是病理学，一直在从事病理科实践工作，在这项工作中，我主要从分子病理的视角进行了方案设计。坦率地说，我看到的很多方法是不太经得起临床实践考验的，或者要在后期不断磨合才符合要求。所以一开始就把临床实践积累的经验带进方案设计，重点考虑如何能够减轻而不是增加病理工作的负担，是我们这项工作的一个突出亮点。这个效应在论文的很多细节都可以体现出来，如对样本年限的评估、质控方法的确立、强调操作的简便易用、对千差万别样本的容忍、强调检测范围须聚焦可用药或耐药靶点、以及检测结果的可靠及可验证。此外，我还负责报告位点的医学解读，临床病理分析以及统计工作。

我认为这项工作给医疗行业， 特别是肿瘤靶向诊治领域带来的影响是深远的，获益的不仅是患者也是病理医生，因为它解决了临床工作中晚期肿瘤病人由于穿刺样本少、只可做一种NGS检测，所造成的众多可治疗靶点阳性患者漏检的问题。另外，病理科日常工作繁重，如果分别开展DNA和RNA两项高通量测序，项目会有很多实际困难，而这个“一管双检”的创新方法为病理科工作提供了很大的便利。

问：作为肿瘤病理学专家，您认为目前在临床上，NGS测序发挥了多大的作用？整体效果如何？有哪些需要解决的问题？

答：当今，肿瘤诊治已迈入个体化及精准医学的时代，从“一刀切”向“针对每一个病人的具体病情，正确选择并精确地应用适当的治疗方法”发展，这对进一步提高治疗的有效性、降低不必要的药物副作用、及节约医疗支出都有着深远的意义。肿瘤的精准医疗是一项系统工程，包括精准诊断、精准治疗、精准管理多个环节，均以精准的肿瘤基因检测为基础。生物技术的进步使得探索具有临床意义的基因异常变得可能。临床肿瘤学实践中，基因检测已成为精准诊治的前提和核心之一， NGS在开展精准诊治实践与试验研究中有着广阔前景，能更好的帮助临床医生在实际临床患者诊疗中，提升诊断水平，做出合理正确决策，提高患者生存质量。

NGS技术正处于不断的发展和完善过程中，我们需对NGS技术现状有正确的认识。在过去十年，肿瘤学界的研究和应用显示：在恰当的技术条件下，NGS确实能够高通量地检测分析肿瘤中的驱动基因变异或治疗性靶点，给部分患者带来治疗和生存的获益。目前关于NGS出现的问题和解决方法，中国肿瘤驱动基因分析联盟推出的中国首部《NGS技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》里面说得比较清楚，主要由36条声明组成，最重要的就是临床肿瘤诊断应用的NGS 项目应符合相应的诊断技术标准。影响NGS结果的限制性因素包括：平台类别、靶区域富集方法、文库构建及扩增效率、测序数据量、生物信息学分析流程等。在临床应用之前，对于特定突变位点的NGS检测结果，在低质量数据条件下应采用其他方法进行结果验证。检测实验室的专家、肿瘤患者的主诊医师与患者应就开展肿瘤NGS分析的利弊进行充分沟通和知情同意，同时让临床医师了解特定NGS测试项目的医学意义。

问：您认为这一创新方法在临床上的应用价值如何？能否满足临床的要求？

答：实践出真知。这个创新方法在临床上应用价值我觉得非常大，因为它解决了我们目前面临的两大问题，低分布突变发现的比例提高以及对样本的要求较少，比如常见的肺癌，常常我们穿刺样本获得的肿瘤组织过少，而这些肿瘤组织还要满足常规的病理HE染色和免疫组化来确诊，这往往会耗费很多组织，而传统的DNA测序或RNA测序对组织要求也比较高，通常出现的情况是晚期肺癌穿刺组织不能既满足病理诊断与分子检测，会出现相互抢标本的现象，而“一管双检”对组织要求相对较少。此外，特殊的原理设计也比其它方法更能容忍已降解的比较短的核酸，能够满足临床诊断与分子检测，让更多的患者获得精准治疗的机会。

问：病理学一直被视为是基础医学与临床医学之间的“桥梁学科”，您如何理解这个问题？与“转化医学”之间是怎样的关系？

答：这个是一个老话题。从我们本科学医阶段，老师就会告诉我们，病理学是研究疾病的病因、发病机制、患病机体的病理变化及疾病转归的一门科学，是沟通基础医学和临床医学的桥梁课。学习病理学基础既要有解剖学、组织学、生理学、生物化学等基础医学知识作为铺垫，又要熟悉相关的寄生虫学、微生物学、免疫学等知识，同时病理学基础又是临床医学如内科学、外科学、传染病学等科目的基础。

传统的基础研究与临床实践往往被一系列的障碍分隔。例如临床实际问题的提出者往往不具备做基础研究的条件；而另一方面大量的基础研究偏离临床实际，研究成果得不到应用。转化医学是将二者连接起来的一种新的理念。目的是将基础研究与解决患者实际问题结合起来，其基本特征是多学科交叉合作，针对临床提出的问题，深入开展基础研究，使研究成果得到快速应用。实现从“实验室到床边”的转化，又从临床应用中提出新的问题回到实验室，为实验室研究提出新的研究思路 。

问：我们知道，您主要从事胸部肿瘤、头颈部肿瘤及黑色素瘤临床及转化医学研究，从您的实际经验来看，您的团队目前关于这些肿瘤的研究情况如何？

答：2014年-2019年期间，我们根据最新版WHO肿瘤组织学分类，建立了一套完善的临床肿瘤组织样本数据库（105513例）体系， 先后完成了本地区10年间（2008-2018）乳腺肿瘤（3343例），肺部肿瘤（8814例），食管肿瘤（9383例），胸腺肿瘤（448例），胸膜肿瘤（287例），心脏肿瘤（21例），胃肿瘤（13082例），肠肿瘤（10773例），阑尾肿瘤（303例），肛管肿瘤（2309例），肝胆胰肿瘤（4579例），女性生殖系统肿瘤（12340例），泌尿系统肿瘤（1333例），男性生殖系统肿瘤（218例），头颈部肿瘤（13417例），甲状腺肿瘤（9157例），甲状旁腺肿瘤（53例），垂体肿瘤（73例），肾上腺肿瘤（189例），软组织肿瘤（9398例），骨肿瘤（484例），中枢神经系统肿瘤（319例），淋巴瘤（3540例），皮肤肿瘤（1422例），眼及附属器肿瘤（155例），脾肿瘤（73例）的流行病学数据分析，研究成果先后在CSCO，CSMO，中国病理年会上以口头发言或壁报交流形式公布。

其中肺癌领域研究的比较深入，在国内率先提出肺癌个体化诊治体系4大亚组（肺癌高危人群筛查、早期非小细胞肺癌术前诊疗规范、GGO型肺癌个体化诊疗策略、非小细胞肺癌个体化诊治应用），并应用于实践。筛查方面率先在街道社区开展公益类科普讲座，并通过低剂量螺旋CT筛查社区肺癌高危人群25000多例，并针对低螺旋CT筛查假阳性问题研发外周血miRNA+lncRNA检测试剂盒，诊疗规范方面通过胸部CT，腹部CT，头颅MRI，支气管镜和EBUS，骨扫描，PET-CT等临床问题进行回顾性研究，建立GGO型肺癌的术前诊治体系。个体化诊疗策略方面，通过系统研究磨玻璃结节型肺癌，建立人工智能预测磨玻璃结节良恶性，肺癌术式对比，肺叶切除+纵隔淋巴结清扫，阐明淋巴结转移规律。

肺癌分子分型方面，EGFR（18, 19, 20, 21外显子，酪氨酸激酶域复制，融合，胞外域），ALK，ROS1，MET（扩增，14跳跃突变，融合），RET，HER2（突变，融合），NRG1，KRAS，BRAF（突变，融合），FGFR等靶向进行深入研究，在世界上首次报道中国人群肺癌中EGFR-RAD51融合（Lung Cancer 2018）和EGFR -SEPTIN14融合（J Thorac Oncol 2019），EGFR KDD（J Thorac Dis 2018），ALK新型融合伙伴FBXO36-（J Transl Med 2018），ROS1新型融合伙伴CEP72-（Thorac Cancer 2018），ZCCHC8-（Cancer Biol Ther 2018），MET新型融合伙伴UBE2H-（J Thorac Oncol 2018），ATXN7L1-（Ann Oncol 2018），第一次报道埃克替尼治疗EGFR常见及少见突变原发耐药和继发耐药机制，奥希替尼治疗EGFR T790M突变原发耐药和继发耐药机制，克唑替尼治疗ALK融合，ROS1融合原发耐药继发耐药机制。

组织亚型方面着重研究了肺肠型肺癌，肉瘤样癌，肝样腺癌，NUT中线癌等少见组织亚型。相关研究成果先后在ASCO，ESMO，AACR，WCLC，ELCC等国际权威肿瘤学会议或USCAP，ESP，JSP等国际权威病理学会议上以口头发言或壁报交流形式公布，并在Ann Oncol，J Thorac Oncol，Clin Chem，Transl Lung Cancer Res，Cancer Sci, Lung Cancer，Clin Lung Cancer, J Transl Med，Transl Oncol，Cancer Med等国际权威肿瘤杂志上发表。其他包括食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、间皮瘤、甲状腺癌等研究目前正在数据整理阶段。

问：我们知道，最近ESMO针对NTRK1这样的高价值融合靶点专门推荐了RNA测序做为一线检测方法的一种选项，NCCN也在最新版本的肺癌指南里建议将RNA测序纳入检测融合的方案以提高检测质量。这是否代表了一种趋势？

答：是的。针对NTRK融合的临床实践标准化检测，2019版ESMO指南推荐NTRK融合在低频突变肿瘤中可考虑“两步方案”（two-step approach），即采用抗pan-TRK抗体IHC方法进行初始NTRK融合的富集，再针对阳性样本进行NGS方法学确认。在具备常规开展NGS的条件时，也建议以NGS为一线，而以IHC对阳性病例进行交叉验证。我们通过几千例样本的比对结果来看，DNA+RNA测序对于EGFR、MET、NRG1、NTRK、BRAF等低频融合突变阳性率明显提高。患者有效，才是对各种检测方法最好的验证，对于这部分患者，入组相应的临床研究也在进行中， 有部分患者已经明显获益，所以未来pan IHC应根据DNA+RNA测序结果来调整。

问：针对“一管双检”技术，下一步的应用计划是什么？

答：融合基因的检测仍然有很多潜力可挖，下一步我们会联合一些临床单位，和恒特基因一起开展“轻舟计划”。这是一个以肺癌为主的泛实体瘤可用药靶点的筛查计划。我们首先梳理了已经获批的靶向药靶点，以及正在或即将开展临床试验的那些融合靶点，确立了“一管双检”需要检测的靶点范围。“轻舟已过万重山”，对于临床诊断，与其去纠结一些生物标志物的治疗指导意义是否明确，或阈值怎么划分，不如聚焦那些意义明确且又有治疗手段的靶点和生物标志物，提高检测质量，简化检测流程。目前这项计划进展顺利，参加的临床单位也越来越多。其次我们看到，目前的基因检测产品大多数局限在肿瘤病因本身，而机体对肿瘤反应的“功能标志物”受关注较少，这是“轻舟计划”的一项重要内容。

也就是说，“一管双检”的PANO-Seq全景测序，并不仅仅是DNA+RNA或融合+突变，而是更广泛意义的病因+应答和靶向+免疫，而且是在保持产品易用性的前提下做到这些。让我们拭目以待吧。

专家介绍